肿瘤就像一个无处不在的恶魔，它善于隐蔽，精于伪装，长于狡诈，在与人类的PK中往往占得上风。然而，肿瘤从一个或者几个“首恶”发展成为有破坏性的“组织”，还是或多或少留下了一些蛛丝马迹。

常规富集手段

CTC在外周血中的含量极少，每10ml血液中可能只含有1个或者几个CTC，但是同时有1亿个白细胞和500亿个红细胞。所以，要对CTC进行分析，第一步必须先进行分离。目前常用的富集方法主要有两大类，物理学法和免疫学法/免疫化学法。前者是根据CTC的细胞大小和密度与血液中其它细胞不同；后者是利用CTC表面的分子标记物来将其进行区分。

1、密度梯度离心法

血液中各种细胞的密度不同，离心后在细胞分离液中会呈现梯度分布。利用此原理，将患者血液标本加入特定的细胞分离液后进行离心，即可分离出目标细胞。如果将全血在细胞分离液Ficoll中进行密度梯度离心后，从下到上组分依次分布：红细胞、中性粒细胞、单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞、肿瘤细胞），最上层是血浆。

由于肿瘤细胞会移入上层的血浆中，所以后来出现了改进的技术-OncoQuick（德国Greiner公司）。OncoQuick用一种专用的50mL试管，内置多孔屏障，其下为密度梯度分离液，使用时将标本置于屏障之上，从而避免在离心之前与分离液混合而污染。OncoQuick分离法与传统的Ficoll分离法相比，前者对肿瘤细胞的平均回收率更高，富集效果更好。但是，即便经过改进，这种依靠密度梯度分离CTC的方法的局限性依然显而易见，比如CTC组分中会因为掺杂其它细胞导致产物不纯。同时也恰恰因为互相掺杂，导致一部分CTC被舍弃，使得本就很稀少的CTC甚至检测不到，影响其灵敏度。

图1：Oncoquick分离全血示意图。

2、过滤法

2000年，Vona等报道了一种依据细胞大小，通过过滤直接富集上皮性肿瘤细胞的方法（isolationbysizeofepithelialtumorcells,ISET）。该方法使用８μｍ孔径的聚碳酸酯（polycarbonate）膜来过滤血液，较小的淋巴细胞和中性粒细胞可以通过，而较大的肿瘤细胞则被阻滞在膜上。该方法的显著优点是操作非常简单，可以避免多步骤分离造成的稀少细胞的破坏和丢失。另外，通过该方法分离的CTC形态和结构保持完好，有利于后续分析。重复性实验显示，ISET可从1ml血中将掺入的１个肿瘤细胞分离出来。其局限性在于一些较大的白细胞容易与肿瘤细胞混在一起，而一些较小的CTC也容易被滤过而丢失，因此这种方法灵敏度和特异性都存在问题。

图2：ISET法分离CTC以及后续研究

3、免疫磁珠法

图3：CellSearch分离检测CTC。

CellSearch系统已被美国FDA批准应用于临床，目前主要应用于预测转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无病生存期（Disease-freesurvival，DFS）和总生存期（Overallsurvival，OS）。临床应用结果表明，通过CellSearch系统检测CTC是传统医学影像学、血清学的有益补充，可以判断当前肿瘤治疗方案的有效性，提供用药指导，并有效评估患者的预后。该方法简便、易行，而且可以对同一患者进行连续监测。CellSearch后续也被逐步发展试用于检测其他肿瘤患者的CTC。由于某种原因，2016年初强生停止销售该产品。

4、CTC芯片

2007年，美国麻省总医院癌症中心与强生公司合作，研发出一种能检测出极微量CTC的微流体硅芯片，称为CTC-Chip。该芯片的表层密布了近8万个包被EpCAM抗体的微位点，当血液样本流过芯片时，该抗体可与肿瘤细胞表面EpCAM相结合从而粘附肿瘤细胞。这种方法能在10亿个以上的血细胞中检出单个癌细胞，但尚未用于临床。

2010年，该机构成功升级CTC-Chip，称为HB-Chip（herringbone-chip）。与第一代CTC-Chip相比，HB-Chip具有以下优点：（1）芯片的表面形状从光滑改进为人字形交叉沟槽状，这样在血液样本流过芯片时会形成微漩涡，增加了与芯片表面所粘附抗体互相接触的机会，可更有效地捕获数量极少的循环肿瘤细胞。研究表明，HB-Chip可捕获血液样本中90%以上癌细胞，较CTC-Chip的分离效率提高25%。（2）HB-Chip能捕捉到CTC-Chip或其他CTC分离设备从没有发现过的循环肿瘤喂栓子（circulatingtumormicroemboli，CTM）。对CTM的深入研究可能会进一步揭示肿瘤的转移特性。（3）该芯片配备了一个标准的载玻片，可以使用传统的病理检查方法来鉴别癌细胞。（4）更容易操作，而且可以处理更大容量的血液样本，因而能用于较大规模的临床研究。

图4HB-chip捕获CTC

升级技术

随着流式细胞技术、微流控技术、纳米技术的发展，CTC的分离技术逐渐出现融合的趋势，大大提升了CTC分离的灵敏度和特异性。

ISET联合激光扫描细胞计量仪（laserscanningcytometry，LSC）是近年来应用于CTC检测领域的一项新技术。该技术先利用ISET原理将肿瘤细胞从外周血细胞中分离出来，然后应用LSC对已经标记荧光抗体的细胞进行扫描识别，从而可以准确检测到外周血中所含有的极微量肿瘤细胞。该方法与Cellsearch检测系统相比，ISET不依赖于相关抗原-抗体反应而直接过滤外周血进行肿瘤细胞富集，操作简单方便，减小了肿瘤细胞的丢失；而且这种物理分离法不会破坏肿瘤细胞的形态学特征。所以，ISET能从少量外周血中筛选出肿瘤细胞，并为下一步的形态学、细胞学以及分子生物学研究提供条件。后续的LSC可对所检测到的阳性细胞进行进一步目测确认，提升了CTC检测的准确性。

2013年，麻省总医院的团队在第一代CTC-chip和第二代HB-chip的基础上，开发出了第三代技术，称为iChip（inertialfocusing-chip）。该技术通过流体作用力将细胞排成一列纵队，芯片利用流体力学分选，去除最小的血液成分。然后，它利用正向选择来去除淋巴细胞，保留剩下的一切。iChip比人字形芯片要快得多，每小时能处理20ml血液。它还能产生未标记的细胞，便于培养和分析。该技术实际上整合了物理分离法和免疫分离法，对CTC的分离效果大大提升。

曙光初现，任重道远

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